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制药产业中的生物催化

作者:N/A    | 公布工夫:2015-06-06

因为具有回响反映前提温文、催化效力下和专一性强的长处,应用生物催化或生物转化等生物要领来生产药物的组分已成为现今生物技术研究的热点课题。继医药和农业以后,产业生物催化曾经被以为是“生物技术的第三次海潮”,其中心则是生物催化剂的运用和消费。生物催化剂重要有两种:齐细胞和游离酶,二者的本质都是酶,但前者酶保存正在细胞中,后者酶则已从细胞中星散纯化关于需求应用一种以上的酶和辅酶的庞大回响反映或酶不克不及游离运用的回响反映,一般接纳齐细胞的生物转化,不然为了简朴起见则挑选游离酶。据推想,自然界中约有25000种酶,个中已被承认的有300多种。凭据酶催化的回响反映范例,可将酶分为六类:氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂合酶、异构酶和联络酶。

正在消费小份子的药物及中间体时,生物转化和传统的化学要领最明显的区分就是异常有效地不对称分解手性化合物。手性是生物体的基本特征,手性药物是指有药理活性的光学纯化合物,体内很多内源性化合物,包孕取药物发作感化的自然大分子皆具有手性。人体的手性情况能够辨认手性药物对映体,使对映体的药代动力学和药理学泛起差别,差别手性的药物做用于生物体时,它们所起的感化是差别的,正在活性、代谢历程及毒性等方面存在明显差别。恰是基于那一缘由,开辟单一对映体形式的合成药成为远几年的研讨热点。

凭据Technology Catalysts International(TCI)的统计,2000年,手性药物的销售额增添了13%,到达133亿美圆,并且TCI展望,到2008年,那一数值有可能到达200亿美圆,2000年,正在市场上贩卖的所有药物中,有40%为单一对映体,而正在1999年,仅三分之一为单一对映体[1]。生物催化剂借能分解典范的化学要领难以分解的非手性小份子化合物,另外酶还可用于消费大分子的化合物,如和有医治感化的蛋白质。

1 生物催化剂的运用

现在异构酶和联络酶正在那一范畴的运用借较少,因而本文重要对氧化还原酶、转移酶、水解酶和裂解酶正在制药产业中的运用状态停止综述。

1.1 氧化还原酶

氧化还原酶是一类催化物资停止氧化复原回响反映的酶类,被氧化的底物就是氢或电子供体,这类酶皆需求辅佐因子到场。据估计所有的生物转化历程触及的生物催化剂有25%为氧化还原酶。凭据受氢体的物资品种可将其分为4类:脱氢酶、氧化酶、过氧化物酶和加氧酶。

1.1.1 脱氢酶

脱氢酶的受氢体绝大部分是尼克酰胺二核苷酸(磷酸),作为辅佐因子的尼克酰胺核苷酸有两种:NAD+和NADP-。氧化复原回响反映正在尼克酰胺环上停止,氧化状况时环上N为4价,写成NAD(P)+,复原后则写成NAD(P)H。脱氢酶是以辅酶或辅基为受氢体,以是又称为不需氧脱氢酶。Bommmarius等[2]应用亮氨酸脱氢酶,以差别的酮酸为底物分解了一系列手性(见图1)。正在那一要领中,辅佐因子经由过程甲酸脱氢酶再生。


图1 脱氢酶催化酮酸化为手性氨基酸
Omapatrilat是血管重要素转化酶和肽链内切酶的抑制剂,临床上可用于医治高血压。L-6-羟基己氨酸是用于分解Omapatrilat的手性中间体,离别以氨基酸氧化酶和谷氨酸脱氢酶为催化剂,经由过程两步回响反映可将外消旋-6-羟基己氨酸转化为L-6-羟基己氨酸,转化率为97%,对应体过量(e,e值),大于98%(见图2)[3]。

1.1.2 氧化酶

氧化酶以氧份子为受氢体,以是又称为需氧脱氢酶。这类酶常需求黄素核苷酸(FMH或FAD)为辅酶,且联合严密,故又称黄素卵白。



图2 酶法分解L-6-羟基己氨酸

 

氨基酸氧化酶催化氨基酸转化为响应的酮酸,逆反应则由脱氢酶催化,比方以C为质料,二步酶法制备7-氨基头孢烷酸(7-ACA)(见图3)[4]。

阿昔洛韦是一种无环的鸟苷构造类似物,重要用于抑止纯真疱疹病毒I、II型及E-B病毒感化。黄嘌呤氧化酶能催化种种露氮杂环化合物的地区挑选氧化。应用那一性子,能有效地将6-脱氧阿普洛韦氧化成阿昔洛韦(见图4)[5]。



图3 酶法制备7-氨基头孢烷酸



图4 酶法制备阿昔洛韦

1.1.3 过氧化物酶

过氧化物酶常以黄素FAD、血红素为辅基担当H2O2取过氧化物的剖析取转化,催化以H2O2为氧化剂的氧化复原回响反映。佳息患是HIV-I蛋白酶抑制剂,临床上用于爱滋病的医治。消费佳息患的一个要害中间体反-1S,2R-氨基茚醇能以手性的1S,2R-环氧茚为前体分解,而以Curvularia protuberate MF5400中的溴过氧化物酶和脱氢酶为催化剂,可间接将茚转化为1S,2R-环氧茚(见图5)[6]。

图5 酶法分解1S,2R-环氧茚

 

1.1.4 加氧酶

这类酶常随同羟基构成,故又称为羟化酶。和氧化酶差别,它催化氧原子间接参入有机份子,可凭据回响反映系统中氢供体数量分为两个亚类:单加氧酶和双加氧酶。

比方,正在降血糖药物格列吡嗪(glipizide)的分解中,个中一个前体就是正在生物催化剂的催化下,间接将甲基基团上的一个非活化碳间接氧化而成(见图6)[7]。


图6 酶法分解格列吡嗪的前体

 


内酯化合物是主要的手性构架。Stewart[8]等将Acinetobacter sp NCIB9871中的环己酮单加氧酶正在面包(Saccharomyces cerevisiae)中停止表达,并以该酵母齐细胞为催化剂催化不对称的拜我-维利格氧化回响反映,分解了一系列的内酯化合物(见图7)。

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图7 环己酮单加氧酶催化的差别对称的拜我-维利格氧化回响反映

1.2 转移酶

转移酶能催化一种底物份子上的特定基团(比方酰基、糖基、氨基、磷酰基、甲基、醛基和羰基等)转移到另一种底物份子上,正在许多场所,供体是一种辅佐因子(辅酶),它是被转移基团的携带者,以是大部分转移酶需有辅酶的到场。正在转移酶中,转氨酶是运用较多的一类酶。这类酶一般皆需求磷酸砒哆醛为辅酶。磷酸砒哆醛是B6的衍生物,它除到场转氨基回响反映之外,也是脱羧回响反映和消旋回响反映的辅酶。回响反映过程中先要构成生动的西夫碱,然后再凭据酶的催化特性停止响应的回响反映。转氨酶的特性是底物特异性低,反应速度快,已被用于大规模分解非自然氨基酸,以知足消费手性药物的需求[9]。L-同型苯丙氨酸是抗高血压药依那普利(enalapril)的组分。D-苯丙氨酸和L-叔丁亮氨酸分别是抗血栓药和抗爱滋病药的组分。

L-丝氨酸是一个主要的药用氨基酸。孙进等[10]应用丝氨酸羟甲基转移酶催化甲醛和甘氨酸,可逆天分解L-丝氨酸(见图8),回响反映历程中丝氨酸羟甲基转移酶需求PLP和四氢叶酸作为辅佐因子。终究回响反映液中L-丝氨酸浓度到达0.2 mmol/L,该法是现在最有运用远景的L-丝氨酸消费要领。



图8 酶法分解L-丝氨酸

1.3 水解酶

水解酶是指正在有火列入下,把大分子物资底物水解为小份子物资的酶,大多不可逆,一样平常不需要辅佐因子。此类酶发明和运用数目日删,是现在运用最广的一种酶,据估计,生物转化应用的酶约三分之二为水解酶。正在水解酶中,运用最多的是脂肪酶,别的借包孕酯酶、蛋白酶、酰胺酶、腈水解酶、磷脂酶和环氧化物水解酶。因为脂肪酶较易得到,正在已报导的生物转化历程约有30%取脂肪酶有关。常用的脂肪酶包孕猪胰脂肪酶、假丝酵母属脂肪酶、假单孢杆菌属脂肪酶和毛霉属脂肪酶。比方用流动化脂肪酶分解抗高血压病药物天尔硫卓(diltiazem)的一个要害中间体(见图9)[11]。正在那一历程中,目标产品的产率为40%~43%,光学纯度(e,e值)为100%。


图9 脂肪催化分解天尔硫卓的中间体


?酶法拆分也已普遍应用于制药产业。比方抗癌药物泰素(taxol,野生半分解紫杉醇)的β-氨基酯侧链就是用脂肪酶催化拆分外消旋氮杂环丁酮衍生物分解的(见图10)[12]。


图10 酶法制备泰素的β-氨基酯侧链

酰胺酶一般含有Zn2+,它们催化L-氨基酸酰胺的水解。比方用恶臭假单孢菌中的酰胺酶能够分解癫痫病附加医治药哌啶酸的衍生物(见图11)[13]。

图11 酶法分解哌啶酸的衍生物

该拆分工艺的消费范围已到达吨以上(e,e值大于99%),并且副产物可经由过程静态拆分轮回应用。另一个运用较广的酰胺酶是乙内酰胺酶,该酶常用于大规模制备D-氨基酸。比方用乙内酰胺酶工业化消费阿莫西林的侧链D-对羟基苯甘氨酸(见图12)[14],正在该工艺中,非目标对映体可经由过程静态拆分轮回应用。


 

图12 两步酶法分解D-对羟基苯甘氨酸

用磷酸化酶作为催化剂可制备自然和非自然的核苷。比方,用两步酶法分解抗病毒药利巴韦林(见图13)[15]。

图13 酶法分解抗病毒药利巴韦林

 

D-泛酸钙为维生素类药物,用D-泛解酸内酯水解酶将DL-泛解酸内酯拆分获得D-泛解酸内酯,再取β-丙氨酸钙缩合消费D-泛酸钙。该要领工艺简朴,本钱低,从情况角度思索也有益[16]。

R-3-羟基4-腈丁酸乙酯是消费降胆固醇药阿妥伐他汀(Atorvastatin,商品名Lipitor)的中间体。正在已报导的用2,3-二羟基氯丙烷分解该中间体的要领,需求6步回响反映,而用腈水解酶催化表氯醇分解该中间体只需3步回响反映(见图14)[17]。



图14 腈水解酶催化表氯醇分解R-3-羟基-4-腈丁酸乙酯

 

1.4 裂解酶

裂解酶催化小份子正在不饱和键(C-C,C-N和C-O)上的加成或消弭、裂解酶中的醛缩酶、转羟乙醛酶和氧腈酶3类酶正在构成C—C时具有高度的立体选择性,因此日渐引发存眷。用醛缩酶催化的醛缩回响反映可用于将醛的长度延伸2个或3个碳单位。类似于化学醛缩回响反映,该回响反映能够是将一个稳固的带负电的碳加到醛上,并具有高度立体选择性。


比方用流动化醛缩酶分解N-乙酰神经氨酸已到达吨以上的范围(见图15)[18]。N-乙酰神经氨酸为神经氨酸苷酶抑制剂的前体,该抑制剂临床上用于医治病毒性流感。

 


图15 酶法分解N-乙酰神经氨酸

多巴胺是哺乳动物中枢神经系统的神经通报量,也是激素降肾上腺素和肾上腺素的前体。临床上用于医治急性循环系统不全和低血压。以3,4-二羟基-L-苯丙氨酸(L-DOPA)为底物,L-DOPA脱羧酶为催化剂可分解多巴胺(见图16)[19]。


 

图16 酶法分解多巴胺

正在奇姻回响反映中胜利的例子就是产业上用裂解酶制备L-麻黄素的前体(见图17)[20],此回响反映所用的酶为丙酮酸脱羧酶,该酶需用焦磷酸硫胺素(TPP)作为辅佐因子。

 

图17 酶法分解L-麻黄素的前体

2 制药产业中生物催化剂的消费

因为的消费需求挑选,培养高产菌株,同时因为酶的生存和运用的情况有对照严厉的要求,以是运用正在大规模工业化上的酶其实不是多见。个中现在大规模运用正在制药行业中的有酰化酶、D-氨基酸氧化酶等。这些酶的流动化手艺曾经很成熟,我国正在青霉素酰化酶的消费技术上曾经跟西方国家大公司的相差无几,我国自行研发的来自枯草杆菌和伟大芽孢杆菌和大肠杆菌的青霉素酰化酶早就正在工业化大规模消费中运用,价钱也被海内制药公司所接管。

正在对映体选择性分解和官能团区域性挑选转化历程中,酶黑白常有效的东西。正在有机合成中,生物转化实用的局限也较广。比年酶工程范畴络续出现很多新的手艺,如抗体酶、人工合成酶、模仿酶、交联酶晶体等都是现今酶学研讨范畴的热点。另外应用基因工程手艺、蛋白质工程技术改进原有酶的种种机能;应用基因工程手艺将本来有害的、未经核准的微生物发生的酶的基因,或由发展迟缓的、动植物发生的酶的基因,克隆到平安的、发展敏捷的、产量较下的微生物体内,改由微生物来生产。跟着这些手艺的生长取完美,将来势必会有更多的生物催化历程被应用于制药产业[21]。

收稿日期:2003-2-18

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